Co je fluorescenční spektroskopie?
Fluorescenční spektroskopie analyzuje fluorescenci molekul na základě jejich fluorescenčních vlastností.
Fluorescence je luminiscence, ke které dochází, když je molekula excitována fotonem do elektronicky excitovaného stavu, aby se vrátila do základního stavu.
Fluorescenční spektroskopie využívá paprsek světla k excitaci elektronů v určitých molekulách sloučenin a přimět je, aby emitovaly světlo. Světlo prochází monochromátorem a vstupuje do detektoru, kde je detekováno, což se používá k měření a identifikaci molekul nebo změn v molekulách.
Úvod do fluorescenční ustálené{0}}spektroskopie a celoživotního testování
Fluorescence obecně odkazuje na fenomén luminiscence, světla emitovaného molekulami. Existuje několik typů záře.
Fotoluminiscence je emise fotonů excitovaných světelnou energií nebo fotony.
Chemiluminiscence, definovaná jako luminiscence fotonů excitovaných chemickou energií, zahrnuje bioluminiscenci, jak je vidět u světlušek a mnoha mořských živočichů.
Elektroluminiscence je emise fotonů, když elektrická energie nebo silné elektrické pole stimuluje fotony, jako například v některých aplikacích osvětlení.
Konkrétně fluorescence je druh fotoluminiscence, kdy světlo uvádí elektrony do excitovaného stavu. Vybuzený stav rychle ztrácí tepelnou energii do okolí prostřednictvím vibrací a poté emituje fotony z nejnižšího vybuzeného singletového stavu. Tento proces vyzařování fotonů soutěží s jinými neradiačními procesy, včetně přenosu energie a tepelných ztrát.
Když je použit termín "fluorescence", stejná metoda měření obecně platí pro kteroukoli z výše uvedených tříd luminiscence.
Co je fluorescenční spektroskopie?
Fluorescenční excitační a emisní spektra se vzájemně zrcadlí. Fluorescenční spektroskopie využívá emise a excitaci k tomu, aby zjistila, jak se vzorek mění.
Obr. 1: Fluorescenční excitační spektrum (modré) a emisní spektrum (fialové) jsou vzájemně zrcadlové obrazy
Fluorescenční spektroskopie v ustáleném stavu -je, když molekula fluoreskuje, když je excitována konstantním zdrojem světla, a emitované fotony nebo intenzita jsou detekovány jako funkce vlnové délky. Fluorescenční emisní spektrum je, když je excitační vlnová délka pevná, emisní vlnová délka je skenována a je získán vztah mezi intenzitou a emisní vlnovou délkou.
Fluorescenční excitační spektrum je, když je vlnová délka emise pevná, změnou vlnové délky excitačního monochromátoru, skenováním intenzity při různých vlnových délkách. Tímto způsobem spektrum poskytuje informace o vzorku a absorpčních vlnových délkách pro výběr optimální jediné emisní vlnové délky pro detekci emise. Je podobná absorpční spektroskopii, ale je to citlivější technika, pokud jde o detekční limity a molekulární specificitu. Excitační spektra jsou specifická pro jednu vlnovou délku/druh emise, ve vztahu k absorpčním spektrům všech absorbujících látek v měřeném roztoku nebo vzorku. Emisní a excitační spektra daného fluoroforu jsou navzájem zrcadlovými obrazy. Typicky se emisní spektra objevují na vyšších vlnových délkách (nižších energiích) než excitační nebo absorpční spektra
Tyto dva spektrální typy (emise a excitace) se používají k pozorování, jak se vzorek mění. Spektrální intenzita a špičková vlnová délka se mohou měnit s proměnnými, jako je teplota, koncentrace nebo interakce s okolními molekulami. To zahrnuje zhášení molekul a molekul nebo materiálů zapojených do přenosu energie. Některé fluorofory jsou citlivé na vlastnosti prostředí rozpouštědla, jako je pH, polarita a určité koncentrace iontů.
Jaké typy molekul nebo materiálů vykazují fluorescenci?
Fluorescenční emisní spektra některých běžných fluoroforů. Fluorofory hrají ústřední roli ve fluorescenční spektroskopii a činí z tohoto typu spektroskopie vysoce citlivou techniku.
Obr. 2: Fluorescenční emisní spektra některých běžných fluoroforů napříč UV a viditelným spektrem
Fluorescenční molekuly a materiály přicházejí ve všech tvarech a velikostech. Některé jsou ze své podstaty fluorescenční, jako je chlorofyl a aminokyselinové zbytky tryptofan (Trp), fenylalanin (Phe) a tyrosin (Tyr). Jiné jsou molekuly syntetizované jako stabilní organická barviva nebo značky, které lze přidat do jiných ne-fluorescenčních systémů. Organické fluorescenční molekuly mají obecně strukturní rysy, jako jsou aromatické kruhy a π-konjugované elektrony. V závislosti na své velikosti a struktuře organická barviva vyzařují světlo ve vlnových délkách od ultrafialového po blízké -infračervené.
Níže jsou uvedeny některé náhodné běžné fluorofory, jejichž emise lze pozorovat v rozsahu UV-Vis. U některých prvků vzácných zemin, jako jsou lanthanoidy, v důsledku zaplnění vyšších elektronových orbitalů dochází k elektronovým přechodům v důsledku přenosu náboje z kovových ligandů mezi orbitaly 4f-5d nebo dokonce 4f-4f. (Bunzli, 1989) V přírodě existuje mnoho molekul, které vyzařují světlo, jako jsou některé aminokyseliny, chlorofyl a přírodní pigmenty. Ještě další jsou pečlivě navrženy pro speciální použití ve fluorescenční spektroskopii
Příklady fluorescenčních molekul a materiálů:
Aminokyseliny (Trp, Phe, Tyr)
Deriváty párů bází (2-AP, 3-MI, 6-MI, 6-MAP, pyrrol-c, tC)
chlorofyl
Fluorescenční proteiny (FP)
Organická barviva (fluorescein, rhodamin, n-aminokumariny a jejich deriváty)
Prvky vzácných zemin (lanthanoidy)
polovodič
kvantové tečky
jednostěnné uhlíkové nanotrubice-
Solární baterie
Pigment, galvanické pokovování
fosfor
Více…
Jiné molekuly a materiály, jako jsou fluorescenční proteiny, polovodiče, fosfory a prvky vzácných zemin, jsou běžně používané fluorescenční vzorky. Polymery obsahující konjugované aromatické uhlovodíky nebo dieny mají často také fluorescenční vlastnosti. Vědci samozřejmě pracovali i na vytváření nových materiálů.
